因業務調整，部分個人測試暫不接受委托，望見諒。

細胞劃痕實驗步驟

　　1、劃線：先用 marker 筆在 6 孔板背后，用直尺比著，均勻的劃橫線，大約每隔 0.5～1cm 一道，橫穿過孔，每孔至少穿過 5 條線;

　　2、鋪板：處于對數生長期的細胞，胰蛋白酶消化成單細胞懸液，接種于 6 孔培養板;細胞鋪板 6w/孔，接種原則為過夜后融合率達到 100%，每孔最終的培養基總量 2mL;

　　3、細胞培養 37℃、5%CO2 培養箱中培養 24h;

　　4、劃痕：第二天用 200 微升槍頭比著 6 孔板蓋子或直尺，平行或垂直于背后的橫線劃痕，槍頭要垂直，不能傾斜;

　　5、清洗：PBS 沖洗細胞 3 次，除去劃下的細胞，加入無血清培養基;

　　6、拍照：擦去 6 孔板背后的 marker 橫線劃痕。4 倍鏡下進行拍照，保證劃痕居中且垂直，注意背景一致，加入待測樣本，設置濃度梯度，可按 0,6,12,24h 時間點取樣，拍照。

　　7、結果分析，使用 ImageJ 軟件打開圖片后，隨機劃取 6 至 8 條水平線，計算細胞間距離的均值或者劃痕面積均值。

　　8、數據處理：

　　細胞遷移率(傷口愈合率)=(初始劃痕面積-t 時刻劃痕面積)/初始劃痕面積細胞遷移率(傷口愈合率)=(初始細胞間距離均值-t 時刻細胞間距離均值)/初始細胞間距離均值

細胞劃痕實驗注意事項

　　1、劃線的目的只是為了輔助劃痕時劃的更直，有利于后續拍照分析，劃線會在拍照前擦去。

　　2、細胞接種數量需根據細胞生長速度和狀態而定，接種原則為過夜后融合率達到 100%，即細胞間沒有空隙，否則會影響后續拍照分析。

　　3、同濃度不同孔之間劃痕最好使用同一只槍頭，減少劃痕距離的誤差。劃痕時槍頭垂直，不能傾斜，可比著直尺或孔板蓋，保持力度一致，一次性劃完。

　　4、沖洗時要溫柔，貼壁加入，避免沖掉單層細胞，反復多次沖洗，盡量洗掉所有的細胞碎片。

　　5、降低細胞增殖對遷移造成的假陽性結果的方法：①使用無血清或低血清培養基(<2%)可降低細胞增殖對實驗結果的影響;②一般認為 24h 為細胞的一個周期，在選取合適的時間點(6,12,24h)檢測劃痕寬度時，最好不要超過細胞一個周期的時間;③如果要單純考慮細胞遷移，可以先用絲裂霉素(1μg/ml)處理 1h，抑制細胞的分裂。

　　6、盡量保證各個劃痕寬度一致，人工槍頭制造劃痕難以保證劃痕寬度的一致性，影響實驗結果，這也是該方法最大的缺陷，有條件的同學可以選擇 culture Insert(如下圖)，將細胞接種于 Dish 中間的 Insert，培養。細胞長滿 Insert 區域后用鑷子移除 Insert 即可產生 500um、1000um 寬度的劃痕。

　　7、不是所有的細胞都適合劃痕實驗，一些細胞呈團簇狀生長，懸浮細胞更不能進行劃痕實驗。

　　工程師會根據不同產品類型的特點、不同行業和不同國家的法規標準以及客戶的需求，選取相應的檢測項目和方法進行細胞劃痕實驗。

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